植物脯氨酸檢測(cè)試劑盒(茚三酮比色法)
Plant
Proline Assay Kit with Ninhydrin
● 產(chǎn)品組成：
|
組分貨號(hào)
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
PP5040-01
|
試劑1-Pro裂解液
|
125 ml
|
RT
|
|
PP5040-02
|
試劑2-Pro標(biāo)準(zhǔn)液
|
1 ml
|
4℃
|
|
PP5040-03
|
試劑3-Pro顯色液
|
50 ml
|
4℃ 避光
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
脯氨酸(Proline，Pro)是一種環(huán)狀的α-亞氨基酸，呈中性，等電點(diǎn)為6.30，易溶于水。在正常環(huán)境情況下脯氨酸含量較低，但在逆境下(旱、熱、冷、凍、鹽堿等)，脯氨酸常有明顯積累，即積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)。植物脯氨酸檢測(cè)試劑盒(茚三酮比色法)檢測(cè)原理是脯氨酸與茚三酮共熱發(fā)生反應(yīng)，能產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物，以分光光度計(jì)測(cè)定處吸光度，在一定范圍內(nèi)顏色深淺(即吸光度)與脯氨酸濃度成正比。
該試劑盒不使用甲苯等有害溶劑，經(jīng)濟(jì)環(huán)保。
該試劑盒主要用于測(cè)定植物組織中的游離脯氨酸含量，不適用于動(dòng)物及醫(yī)療樣品中脯氨酸的測(cè)定。
按照一次使用1 ml Pro顯色液計(jì)算，試劑盒可以使用50次。
● 自備材料：
植物根莖、葉子等；剪刀；螺蓋離心管或鎖蓋離心管或96孔板；1ml玻璃比色皿；分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀；水浴鍋或干浴器；離心機(jī)
● 操作步驟：
1、 樣本處理：
取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，剪碎，迅速稱取， 按照20mg重量加入1ml Pro裂解液（注意是否已經(jīng)加入無水乙醇）的比例加入Pro裂解液（建議使用1.5ml螺口離心管或鎖蓋離心管），沸水浴或干浴處理20分鐘 (期間間歇混勻)，10000 rpm離心 2分鐘，上清即為脯氨酸提取液，4℃保存?zhèn)溆?。待測(cè)提取液如不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)置于-20℃保存，1-2天內(nèi)穩(wěn)定。
2、 配制系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：
取1ml 試劑1-Pro裂解液全部加入到試劑2-Pro標(biāo)準(zhǔn)液的小管中，混勻后徹底溶解，即配成的Pro標(biāo)準(zhǔn)液（100mg/ml）。
取1 μl 100mg/ml 標(biāo)準(zhǔn)液加入到1ml Pro裂解液中，即配成100μg/ml Pro標(biāo)準(zhǔn)液待用。參照下表配制1-6號(hào)不同濃度的Pro標(biāo)準(zhǔn)溶液。
|
編號(hào)
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
|
100μg/ml Pro標(biāo)準(zhǔn)液加入量（ml）
|
0.01
|
0.02
|
0.04
|
0.06
|
0.08
|
0.10
|
0.15
|
0.2
|
|
Pro裂解液（ml）
|
0.49
|
0.48
|
0.46
|
0.44
|
0.42
|
0.4
|
0.35
|
0.3
|
|
脯氨酸含量（μg）
|
1
|
2
|
4
|
6
|
8
|
10
|
15
|
20
|
4、 樣品測(cè)定:
=
1 \* GB3 ① 分光光度計(jì)測(cè)定：參考下表設(shè)置反應(yīng)混合液，依次加入試劑：
|
編號(hào)
|
0
|
1-8
|
9-X
|
|
|
空白管
|
標(biāo)準(zhǔn)管
|
測(cè)定管
|
|
試劑1-Pro裂解液
|
0.5 ml
|
-
|
-
|
|
步驟1中的脯氨酸提取液
|
-
|
-
|
0.5 ml
|
|
Pro標(biāo)準(zhǔn)液（步驟3中1-8管）
|
-
|
0.5 ml
|
-
|
|
試劑3-Pro顯色液
|
1 ml
|
1 ml
|
1 ml
|
③ 水浴煮沸或干浴20分鐘，間歇混勻。加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體暴沸濺出，可使用鎖蓋離心管或螺旋蓋離心管。
④ 冰浴或流水冷卻至室溫，10000 rpm離心 2分鐘，如發(fā)現(xiàn)沒有不溶物，也可以不離心。
⑤ 取上清，用空白管作為對(duì)照，取1ml反應(yīng)混合液用分光光度計(jì)測(cè)定520nm吸光度值。
=
6 \* GB3 ⑥ 酶標(biāo)儀測(cè)定：參考下表設(shè)置反應(yīng)混合液，依次加入試劑：
|
|
空白管
|
標(biāo)準(zhǔn)管
|
測(cè)定管
|
|
試劑1-Pro裂解液
|
50 μl
|
-
|
-
|
|
步驟1中的脯氨酸提取液
|
-
|
-
|
50 μl
|
|
Pro標(biāo)準(zhǔn)液（步驟3中1-8管）
|
-
|
50 μl
|
-
|
|
試劑3-Pro顯色液
|
100 μl
|
100 μl
|
100 μl
|
5、 計(jì)算：
以系列脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)(1-8號(hào)管)含量(μg)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)定管的吸光度進(jìn)而計(jì)算其脯氨酸含量。
如使用分光光度計(jì)測(cè)定，根據(jù)如下公式計(jì)算具體樣品中脯氨酸的含量：
植物組織樣品脯氨酸含量(μg/g)=1.5（C×VT）/(W×VS) =3C/W
VT=步驟1中脯氨酸提取液總體積(ml)，此處為1ml
W=步驟1中使用的樣品鮮重(g)
VS=步驟4中測(cè)定時(shí)加入的脯氨酸提取液體積(ml)，本實(shí)驗(yàn)為0.5ml
1.5系數(shù)為步驟4中反應(yīng)混合液體積為1.5ml，取1ml測(cè)定吸光值
