4-18%梯度凝膠配制試劑盒
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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RTD6161
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4-18%梯度膠配制試劑盒
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80次
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● 貨品內(nèi)容：
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組份
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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保存
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1
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RTD6161-01
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低濃度聚合溶液
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250 ml
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4℃
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2
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RTD6161-02
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高濃度聚合溶液
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250 ml
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4℃
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3
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RTD6161-03
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凝膠緩沖液（2×）
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2×250 ml
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4℃
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4
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RTD6161-04
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改良型促凝劑
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10 ml
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4℃，配制后-20℃貯存
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說(shuō)明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理，采用合理設(shè)計(jì)的預(yù)混合配方和配制流程，配合梯度凝膠生成系統(tǒng)（貨號(hào)：RT-GZY02），可以配制得到高質(zhì)量的4-18%聚丙烯酰胺梯度凝膠。
本試劑盒大約可以配制常規(guī)大?。?×10cm）PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定： 1 mm厚度凝膠可以配制約80-85塊膠。
凝膠緩沖液采用中性pH值，配制好的凝膠4℃可以穩(wěn)定貯存一年。
● 運(yùn)輸和貯存：
本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸；組份按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年。
● 特點(diǎn)：
1. 安全：不用接觸有毒粉末；不用單獨(dú)添加有氣味的TEMED；
2. 兼容性廣：制膠溶液中不含SDS，可用于非變性電泳（Native-PAGE）；
3. 穩(wěn)定性好：凝膠緩沖液為中性pH，制備好的凝膠可以4℃穩(wěn)定貯存一年。
● 使用說(shuō)明：
一 凝膠制備：
1.1參照梯度混合儀設(shè)備（貨號(hào)：RT-GZY02）說(shuō)明書，準(zhǔn)備儀器，按照?qǐng)D示將系統(tǒng)連接：
將帶接頭的硅膠管一端插入到梯度混合儀側(cè)方插口（可以選擇連接藍(lán)色閥門），另一端與蠕動(dòng)泵下方硅膠管接頭連接（蠕動(dòng)泵溶液方向是一般為下進(jìn)上出）。藍(lán)色閥門插入到多板制膠器接口，將不帶接頭硅膠管截取適當(dāng)長(zhǎng)度一端與藍(lán)色閥門連接，另一端與蠕動(dòng)泵上方硅膠管接頭連接。藍(lán)色閥門旋鈕方向與硅膠管平行為開啟，旋轉(zhuǎn)至與硅膠管垂直方向?yàn)殛P(guān)閉。梯度混合儀左側(cè)桿狀旋鈕與地面垂直為開啟，旋轉(zhuǎn)與水平面有夾角為關(guān)閉。
1.2 蠕動(dòng)泵使用方法：
按照?qǐng)D示調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵。灌裝速度不要太快。
1.3 多板制膠器使用：
使用前將多板制膠器填充塊兩側(cè)的保護(hù)膜揭掉；
準(zhǔn)備好制膠用的厚玻璃板和短玻璃板。
將厚玻璃板和短玻璃板對(duì)齊并在短玻璃板前方放一張分隔片，此為一套玻板三明治組合；
將多板制膠器放倒，以厚玻板在下的方式放入玻板三明治組合，1.0厚度玻璃板最多可放12套；
插入密封擋板，在最后一塊填充塊或者最后一組玻板組合前插入適量的分隔片以保證玻板和填充塊壓緊，然后擰緊螺絲。
在密封擋板下面小孔插入閥門，并打開閥門（閥門旋鈕與硅膠管平行為開啟）。
1.4 配制溶液：
按照下表配制溶液，以制備12板 4-18% 厚度1.0mm梯度膠為例：
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左槽 18%
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右槽 4%
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貨號(hào)
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名稱
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總體積70
ml
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總體積70
ml
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RTD6161-01
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低濃度聚合溶液
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-
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35 ml
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RTD6161-02
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高濃度聚合溶液
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35 ml
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-
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RTD6161-03
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凝膠緩沖液（2×）
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35 ml
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35 ml
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RTD6161-04
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改良型促凝劑
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18 μl
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高于25℃
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20-30 μl
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低于25℃
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35 μl
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梯度混合儀加入溶液前，首先把梯度混合儀閥門關(guān)閉（旋轉(zhuǎn)旋鈕與水平面有夾角為關(guān)閉）。
加入溶液原則：左槽（靠近旋鈕閥門）加高濃度溶液；右槽（靠近出口）加低濃度溶液。
將磁力攪拌子放入右槽中，打開磁力攪拌器（自備），轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)子。
1.5 灌膠操作：
重要步驟：
灌膠前事先檢查: 梯度混合儀旋鈕是否為開啟狀態(tài)(桿狀旋鈕與水平面垂直為開啟):應(yīng)為開啟
磁力攪拌子是否轉(zhuǎn)動(dòng)：應(yīng)為轉(zhuǎn)動(dòng)
蠕動(dòng)泵是否為關(guān)閉狀態(tài)：應(yīng)為關(guān)閉
多板制膠器閥門是否為開啟狀態(tài)(藍(lán)色旋鈕與硅膠管平行為開啟):應(yīng)為開啟
檢查無(wú)誤后，打開蠕動(dòng)泵，使用a模式，調(diào)節(jié)數(shù)字為25，開始灌膠操作。至多板制膠器中的溶液至頂部接近溢出時(shí)，首先關(guān)閉多板制膠器藍(lán)色閥門（旋鈕與硅膠管垂直為關(guān)閉）；
暫停蠕動(dòng)泵；迅速在梯度混合儀左右槽中加滿蒸餾水，打開蠕動(dòng)泵，徹底沖洗管道。
注：此步驟非常重要，不立即徹底沖洗，殘余的凝膠會(huì)堵塞梯度混合儀和管道。
仔細(xì)插入梳子，盡量一次成功，避免產(chǎn)生氣泡。
37℃ 恒溫箱中凝固2-3小時(shí)。
注：凝固溫度非常關(guān)鍵，當(dāng)室內(nèi)溫度低于18度時(shí)，凝固時(shí)間會(huì)很長(zhǎng)。
1.6 拆膠：
待凝膠凝固好后，打開多板制膠器螺絲，用膠鏟在兩板之間輕輕撬動(dòng)，注意不要誤撬玻璃短板，否則將導(dǎo)致玻璃板和膠之間產(chǎn)生氣泡，使得凝膠無(wú)法使用。用水將每板凝膠沖洗干凈，自封袋封好，加入2 ml 1×電泳緩沖液保持潤(rùn)濕，4℃水平放置。
二 電泳：
2.1 SDS-PAGE變性電泳：
2.1.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris，0.5% SDS）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理：融化-混合-變性-上樣
5×MonoColor蛋白上樣緩沖液常溫?cái)?shù)分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；將蛋白樣品置于95℃中加熱5-10分鐘；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。
2.1.3 電泳過(guò)程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
表三 SDS-PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流（一板膠）
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結(jié)束電流（一板膠）
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電泳時(shí)間
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適用條件
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150V
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35-40 mA
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15-20 mA
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55 + min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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200V
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45-55 mA
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20-25 mA
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45+ min
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節(jié)省時(shí)間
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225V
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40-50 mA
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15-20 mA
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35+ min
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250V
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65-75 mA
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20-25 mA
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30+ min
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300V
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70-80 mA
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25-35mA
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25+ min
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最省時(shí)間
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2.2 非變性電泳（Native PAGE）：
2.2.1電泳緩沖液配制：
將5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液干粉（自備，組份0.96 M 甘氨酸，0.125 M Tris）全部倒入1L燒杯中，加入約900 ml水徹底溶解，用水定容至1 L，即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（此溶液不用調(diào)節(jié)pH值）。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理：融化-混合-上樣
5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液常溫?cái)?shù)分鐘解凍后輕輕搖勻，以確保溶液混合均勻；將緩沖液與蛋白樣品按照1：4的比例混勻，如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液；蛋白樣品加入凝膠加樣孔內(nèi)電泳。注：非變性電泳樣品不能加熱處理。
2.2.3 電泳過(guò)程；
在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔)，輕輕的撥出梳子，用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
表四 Native PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時(shí)間
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適用條件
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推薦電壓
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150V
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25-35/板膠
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5-10 mA/板膠
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60 + min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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三. 染色：
1. 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液或常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液（以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
2. 搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至條帶清晰可見。
3. 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫?fù)u動(dòng)10-15分鐘至背景干凈。
4. 觀察保存結(jié)果。